RNA m5C甲基化图谱并揭示早期发育的表观调控新机制

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2025年8月8日，生殖医学与子代健康全国重点实验室、南京医科大学附属苏州医院黄伯贤教授团队通过整合RNA-Bisulfite测序（RNA-BS）、转录组测序（RNA-seq）、染色质可及性测序（ATAC-seq）和CUT&Tag测序等多组学技术，首次系统构建了妊娠早期（9-12周）人类七种主要胎儿组织（脑、心、肝、肺、肾、肌肉和胃）的mRNA m5C（5-甲基胞嘧啶）修饰图谱。研究发现m5C修饰在胎儿发育过程中呈现显著的组织和阶段特异性动态变化，其中脑组织表现出最高丰度的m5C修饰水平，并与基因表达稳态、可变剪切等关键发育过程正相关。相关研究成果以“RNA-m5C regulatory atlas of human fetal tissues uncover the activities of Nsun2/Jarid2/Alyref axis“为题发表于《Journal of Advanced Research》(JAR)。
英文标题：RNA-m5C regulatory atlas of human fetal tissues uncover the activities of Nsun2/Jarid2/Alyref axis
中文标题：人类胎儿组织的RNA m5C调控图谱揭示了Nsun2/Jarid2/Alyref轴活性
发表时间：2025-8-8
发表期刊：Journal of Advanced Research
影响因子：IF13/Q1
技术平台：RNA-Bis-seq、RNA-seq、ATAC-seq、CUT&Tag（易基因金牌技术）
作者单位：南京医科大学姑苏学院
DOI:10.1016/j.jare.2025.08.004
m5C是一种对胎儿发育至关重要的RNA修饰，但其在不同组织中的特异性分布及调控机制尚未阐明。
本研究旨在构建人类胎儿组织m5C分布的高分辨率组织特异性图谱，并解析RNA甲基化与表观遗传调控互作。研究对七种不同的人类胎儿组织同时进行了m5C甲基化分析（RNA-BS）和转录组分析（RNA-seq），结合斑点印迹实验（Dot Blot）、免疫荧光显微镜、免疫共沉淀（Co-IP）、CUT&Tag和ATAC-Seq等多种实验方法，以研究Nsun2介导的m5C修饰影响胎儿发育过程中的染色质可及性状态和组蛋白修饰模式。
研究在建立首个人类胎儿组织m5C修饰的综合图谱并揭示其组织特异性甲基化模式的基础上，进一步证实m5C修饰的转录本主要通过可变剪切维持基因表达稳态，并调控关键发育转录机制。具体而言，研究者发现Nsun2先招募Jarid2/Ezh2复合体，后通过Alyref以m5C依赖性方式调控其活性，从而协调组蛋白修饰和染色质可及性，支持正常的胎儿发育。
本研究构建了一个单碱基分辨率、基本覆盖人类胎儿发育期的不同组织特异性m5C图谱，可作为发育表观遗传学研究的重要资源。此外，研究者发现Nsun2/Jarid2/Alyref通路轴整合RNA甲基化、组蛋白修饰和染色质可及性，以精确调控胎儿发育，深化对表观遗传调控的理解，并为发育障碍的潜在治疗靶点提供了新见解。
研究摘要
 
易基因相关拓展性产品展示

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研究方法

（1）动物模型
Nsun2条件性敲除小鼠模型：使用Nestin-Cre驱动在神经前体细胞中特异性敲除Nsun2，研究其对胎儿大脑发育的影响。
Nsun5全身性敲除小鼠模型：用于对比研究另一m5C甲基转移酶的功能。
人神经前体细胞（hNPC）模型：构建Nsun2敲低（KD）、Alyref过表达（OE）及Nsun2催化位点突变（Mut，C271A/C321A）的细胞系，进行体外机制验证和挽救实验。
（2）多组学测序技术：
RNA-BS(RNA-Bis-seq)：对21个胎儿组织样本（7种组织×3个生物学重复）进行了m5C甲基化测序，在全转录组范围内单碱基分辨率地精确鉴定m5C修饰位点。
RNA-seq：对相同的21个样本进行转录组测序，分析基因表达水平并与m5C修饰数据进行关联分析。
ATAC-seq：在Nsun2条件性敲除小鼠模型中评估染色质可及性，揭示染色质开放区域变化。
CUT&Tag：研究组蛋白修饰（H3K27me3, H3K27ac）在基因组上的定位和富集情况。
（3）分子与细胞生物学实验：
IF：检测神经元标记物（NeuN, Tuj1, Map2, Satb2等）、增殖/凋亡标记物、组蛋白修饰等表达与定位。
Western Blot和Dot Blot：定量检测蛋白表达水平及整体m5C修饰水平。
Co-IP：验证Nsun2、Ezh2、Jarid2、Alyref等蛋白之间的直接互作。
mRNA稳定性实验：使用转录抑制剂放线菌素D（Act-D）处理，检测EZH2和JARID2 mRNA半衰期。
结果图形

（1）胎儿主要组织类型中的m5C特征

本研究首先对妊娠早期（9-12周）的9个胎儿共21个样本（7种组织各3个重复）进行了RNA-BS分析（图1A）。相关热图分析显示，不同组织间的m5C甲基化水平具有聚类特征，表明m5C修饰具有组织特异性（图1B）。韦恩图分析进一步揭示，大多数m5C修饰位点是组织特异性的，例如大脑中59%的位点和心脏中38%的位点是该组织独有的（图1C）。在所有检测的组织中，胎儿大脑的整体m5C水平显著高于其他组织（图1D）。
研究在全基因组范围内共鉴定出3,460-16,137个m5C位点，分布于1,615-4,299个mRNA上（Fig. 1E-F），其中大部分位于内含子和外显子区域（大脑中分别占35.9%和29.6%）（图1G）。有趣的是，21个样本共鉴定出2,624个m5C转录本，其中845个为未在m5C-Atlas数据库中注释的新转录本，脑组织中这一比例高达54.91%（Fig. 1H），GO分析显示这些新转录本富集于组织分化、线粒体基因表达和非编码RNA转录等过程。
图1：胎儿组织样本的m5C甲基化谱
（2）m5C修饰的转录本与胎儿组织基因表达稳态正相关

为深入解析m5C修饰对基因表达稳态的调控作用，研究通过整合m5C-Seq和RNA-seq数据，将m5C修饰转录本按甲基化水平分为低（L）、中（M）、高（H）三组（图2A）。结果显示，组织特异性越强的转录本其m5C修饰水平越稳定；m5C修饰水平越高的转录本，其基因表达的稳定性（稳态）也越高（图2B，2C）。这种稳定性与mRNA表达水平显著正相关（图2C），提示m5C修饰可能通过增强转录本稳定性来维持表达稳态。这种正相关性在mRNA的不同区域（5’UTR， CDS， 3’UTR）均存在（图2D）。
研究进一步按甲基化水平将基因分为低甲基化组（LMG）和高甲基化组（HMG），LMG组表现出更低的mRNA表达差异（图2E），且大脑组织拥有最多（48.8%）的组织差异性m5C转录本（图2F），这些差异位点主要位于内含子（40.9%）和外显子（28.3%）区（图2G）。值得注意的是，组织差异m5C转录本的修饰水平显著低于组成型转录本（图2H）。
上述结果共同支持m5C修饰作为基因表达稳态的"稳定器"：通过在高表达基因上维持一致的修饰水平，确保发育关键基因在时空上的精确剂量调控，而组织特异性低水平修饰介导动态调控。
图2：m5C甲基化与胎儿早期发育阶段的基因表达稳态相关
（3）胎儿组织与成体组织类型间的m5C修饰动态变化

为探究m5C修饰的发育阶段动态变化，研究整合了已发表的成体组织m5C数据（5种匹配组织）进行比较分析（图3A）。聚类分析显示胎儿与成体组织阶段的m5C修饰基因存在实质性差异（图3B）。全局比较发现，尽管普遍认为成体甲基化水平更高，但胎儿组织在关键发育基因上的m5C富集度呈现独特的分布模式：胎儿大脑组织的m5C水平在FGF、WNT、BMP等神经发育核心通路中显著偏高（图3F）。并进一步发现“获得性m5C基因”（发育过程中修饰水平上升）数量超过丢失性基因（修饰水平下降）（图3D），且m5C水平变化与mRNA表达呈正相关（图3E, G-H）。
不同阶段差异分析鉴定出548个脑组织显著差异m5C基因，这些基因在成体组织阶段的m5C和mRNA水平共同上调（图3I）。Venn分析筛选出29个（包括Ezh2、Jarid2等表观调控因子）在脑发育和Nsun2敲除模型中共同变化的m5C基因（图3J），功能富集显示其高度参与组织分化、前脑发育、突触组装等过程（图3K）。
图3：从胎儿期到成体期m5C修饰的动态变化
（4）m5C介导的可变剪切调控胎儿发育过程中的转录

研究深入分析了胎儿和成体组织中的7类可变剪切（AS）事件（SE、AF/AL、MX、RI、A3/A5）（图4A），分析结果揭示，在所有七种组织中，m5C介导的AS事件广泛存在（图4B），并且具有高度的组织特异性（七个组织共有m5C-AS基因只有19个）（图4E）。重要的是，m5C介导的AS组剪切受体包含度（PSI）值低于非m5C介导的AS组（图4F），但其转录过程却更快（图4G）。
此外，从胎儿期到成体期，m5C介导的AS基因及其PSI值也发生了动态变化（图4H-I）。研究还发现剪切因子hnRNPL的表达与AS事件数量正相关，而其m5C水平与mRNA表达负相关（图4L-M），提示了m5C可能通过调控剪切因子以作用于AS的复杂机制。
图4：m5C介导的可变剪切调控从胎儿期到成体期的RNA转录
（5）Nsun2缺失导致胎儿大脑发育异常

基于RNA-BS揭示的脑组织高m5C富集特征，研究构建了神经前体细胞特异性敲除Nsun2的小鼠模型（Nsun2d/d）（图5A）。E13.5胎脑分析显示Nsun2缺失小鼠mRNA和蛋白水平下降90%以上，伴随小鼠胚胎大脑结构异常。免疫荧光显示敲除组NeuN+/Tuj1+和Calb1+成熟神经元比例显著升高（图5B-C），而Sox9+/Nestin+神经干细胞、Map2+/Tuj1+未成熟神经元比例下降（图5D-E），提示Nsun2缺失导致神经元早熟分化且成熟受损。
具体而言，Nsun2d/d胎儿脑组织的m5C RNA-BS显示修饰位点数量、修饰基因数和全局m5C水平均急剧降低，差异表达基因（DEGs）中下调基因显著富集于"组蛋白修饰"和"染色质重塑"通路（图5G-H）。GSEA分析显示运动发育、行为调控和细胞分化相关基因集显著抑制（图5I）。Western blot和IF证实Nsun2d/d导致H3K27me3和H3K9me3修饰水平异常升高（图5J-O），且该现象在9周龄成体脑中持续存在。
图5：Nsun2敲除影响胎儿大脑发育
（6）Nsun2缺失通过调控H3K27me3和染色质可及性抑制胎儿大脑功能

进一步的CUT&Tag分析发现，Nsun2敲除导致抑制性组蛋白标记H3K27me3在全基因组转录起始位点（TSS）区域的富集密度显著增强（图6A），而在如Map2、Foxo1等神经元成熟基因的调控区域，出现H3K27me3异常沉积并伴随mRNA表达下降（图6B-C）。
ATAC-seq分析显示，Nsun2敲除后全基因组染色质可及性增加，TSS区信号增强（图6D），共鉴定出7,878个染色质开放区域，包括Tuj1、NeuN等神经元标记基因调控区（图6E-F）。这些开放的染色质区域与H3K27me3信号增加相关，其邻近基因主要参与轴突发生、神经发生和前脑发育等通路（图6G-H）。这些结果揭示了Nsun2通过影响m5C修饰，进而调控组蛋白修饰和染色质构象，从而调控神经发育基因程序的核心机制。
图6：Nsun2缺失影响了胎儿大脑发育过程中的组蛋白修饰和染色质可及性
（7）Nsun2通过Alyref鉴定m5C修饰招募Jarid2/Ezh2并影响其水平

研究人员通过Venn交叉分析Nsun2敲除大脑中的差异m5C基因和胎儿大脑发育过程中的差异m5C基因，结果鉴定出两个关键靶点：组蛋白甲基转移酶Ezh2及其调控子Jarid2（图7A）。m5C RNA-BS数据显示，正常发育过程中和Nsun2敲除后的模型中，Ezh2和Jarid2的m5C水平均显著降低（图7-C），但蛋白水平却异常升高（图7D-G）。
Co-IP实验证实，Nsun2能直接与Ezh2和Jarid2互作，而m5C reader蛋白Alyref也能与Ezh2和Jarid2结合（图7H-L）。功能挽救实验表明，在Nsun2敲低的人神经前体细胞（hNPCs）中过表达Alyref，或将Nsun2的催化活性位点突变（C271A， C321A），都能使异常升高的EZH2和JARID2蛋白水平恢复至正常（图7M-R），表明m5C修饰水平变化是调控的关键。mRNA稳定性实验证明Nsun2敲低后EZH2和JARID2 mRNA降解速率减慢（图7S-T）。揭示m5C通过促进mRNA衰变来调控蛋白翻译效率。
上述结果阐明了一条清晰的调控轴：Nsun2催化Ezh2/Jarid2 mRNA的m5C修饰，Alyref通过识别该修饰并可能与其他蛋白协同，调控这些mRNA的稳定性和翻译效率，从而影响PRC2复合体活性、H3K27me3水平和最终的神经发育结局。
图7：Nsun2/Jarid2/Ezh2/Alyref轴影响了胎儿大脑发育
（8）Nsun5缺失抑制胎儿大脑发育

最后，研究探讨了另一m5C甲基转移酶Nsun5的功能，Dot Blot显示Nsun5敲除小鼠胎儿脑组织中整体m5C水平显著下降（图8A）。在E18.5期，Nsun5敲除导致成熟神经元标记物（NeuN/Satb2， Map2/Tuj1）阳性细胞比例减少（图8B-E），神经前体细胞（Sox2/Nestin）和DNA修复（Sox2/Rad51）相关标记物也减少（图8F-K）。同时，H3K27me3和Ezh2的阳性细胞比例增加（图8L-O）。这些结果表明Nsun5同样对胎儿脑组织发育至关重要，其缺失也会导致m5C水平降低和神经发育异常，但其具体作用机制可能与Nsun2/Alyref轴有差异，需要进一步研究。
图8：Nsun5缺失影响了胎儿大脑发育
结论和启示

本研究通过m5C RNA-BS构建了人类胎儿组织m5C调控图谱，进一步证实了m5C作为调控胎儿发育表观转录组标记的重要作用，尤其是在大脑发育中的Nsun2依赖性修饰网络并结合组蛋白修饰与染色质重塑。其中，Nsun2通过催化Jarid2/Ezh2 mRNA的m5C修饰，经Alyref识别调控其mRNA稳定性和翻译效率，进而维持H3K27me3的精确沉积和染色质可及性，最终确保神经元增殖、分化与成熟的时序性。Nsun5则通过另一通路作用于组蛋白标记，两者共同构成m5C修饰的双重调控机制。
m5C RNA-BS技术是绘制RNA表观遗传图谱、发现动态修饰规律、并最终与表型及深层机制相联系的单碱基分辨率检测技术。未来类似研究（如不同疾病模型、发育阶段、药物处理等）均可借鉴此技术路线，从绘制修饰图谱入手，结合多组学整合分析，系统揭示m5C的调控功能。
关于易基因RNA m5C甲基化测序(RNA-BS)技术
m5C是RNA百余种修饰中研究较多的一种。m5C存在于tRNA上时，可以对翻译进行调节；存在于rRNA上时，可以对核糖体的生物合成进行质控；存在于mRNA上时，则可以影响mRNA的结构、稳定性及翻译过程。
易基因提供适用于不同科研需求的m5C甲基化测序技术：

• 常规mRNA m5C甲基化测序（RNA-BS）：
  
• mRNA分离后首先通过亚硫酸盐处理，非甲基化的C转变为U，m5C修饰的碱基保持不变，结合高通量测序，可以对RNA上的每一个C碱基修饰进行定位与定量。
  
• 常规mRNA +lncRNA m5C甲基化测序（全转录组RNA-BS）：
  

易基因科技建立的升级版m5C RNA甲基化测序服务，去除人rRNA后，剩余RNA经重亚硫酸盐处理后，结合高通量NGS策略，可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。
技术优势：

• 高深度：超高深度重亚硫酸盐处理，检测准确性极高；
  
• 高通量：结合高通量NGS，全转录组范围内检测；
  
• 单碱基：单碱基分辨率，快速检测和分析RNA中的m5C。
  
• 高准确：精确的检测mRNA等每一个C碱基的的修饰水平。
  

研究方向：

• 与m6A甲基化类似，m5C甲基化已被证明与肿瘤、神经系统紊乱、代谢性疾病、病毒感染以及个体发育等密切相关。
  
• 此外，RNA甲基化（m5C）与人类疾病密切相关，其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。
  

 
参考文献：
Hu X, Ding C, Lu J, Li J, Ren X, Xia W, Qian C, Li H, Cheung HH, Huang B. RNA-m5C regulatory atlas of human fetal tissues uncover the activities of Nsun2/Jarid2/Alyref axis. J Adv Res. 2025 Aug 8. doi: 10.1016/j.jare.2025.08.004.
 
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